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原标题：抗凝血酶III对聚碳酸酯聚氨酯PCU抗血栓形成的影响摘要：用热塑性聚碳酸酯脲烷（PCU）（时长AR)制成的箔和血管移植物表面采用气体等离子体处理，结合水凝胶-(1)聚乙二醇双二胺和二羧甲基葡聚糖（PEG-DEX）和(2)聚乙烯亚胺（PEI），并固定人抗凝血酶III（AT）。

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在体外静态和动态游戏辅助自动发卡网条件下测试了它们的生物影响静态试验方法显示，与未处理的PCU相比，内皮细胞、血小板和细菌的粘附显著降低改良的PCU移植物在钱德勒环模型中循环，在37C下与人血循环90 min分析循环前后止血系统参数（凝血、血小板、补体和白细胞活化）。

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PEI-AT显著抑制凝血和血小板的活化，抑制白细胞和补体的活化总之，这两种修饰都显著降低了凝血活化，但只有PEI-AT才产生了抗菌和抗血栓形成的功能一、介绍静态试验方法显示，与未处理的PCU相比，内皮细胞、血小板和细菌的粘附显著降低。

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改良的PCU移植物在钱德勒环模型中循环，在37C下与人血循环90 min分析循游戏辅助自动发卡网环前后止血系统参数（凝血、血小板、补体和白细胞活化）PEI-AT显著抑制凝血和血小板的活化，抑制白细胞和补体的活化总之，这两种修饰都显著降低了凝血活化，但只有PEI-AT才产生了抗菌和抗血栓形成的功能。

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本研究采用了将抗凝血酶III（AT）固定在等离子体处理的热塑性PCU（慢性AR）表面的策略，该PCU由聚乙二醇双二胺（PEG）、羧甲基葡聚糖（DEX）和聚乙烯亚胺（PEI）基水凝胶连接AT是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可使接触激活途径中的蛋白酶失活，主要是激活因子II（IIa，凝血酶）。

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然而，在体外循环手术[16]期间或植入机械支持装置如心室辅助装置[17]游戏辅助自动发卡网后，血液与聚合物表面的接触可导致AT活性的降低AT活性的降低可能导致亚临床凝血、肝素抵抗和临床相关的血栓栓塞事件[6]重组AT的应用可能是对需要体外循环手术[18]的肝素耐药患者避免这些并发症的一种方法。

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此外，Sask和同事将AT-肝素抗凝血复合物固定在分段聚氨酯表面，并通过复合物[19]的AT部分直接抑制凝血酶，改善了该表面的抗凝血性能在这项工作中，人类AT被用于修饰与不同水凝胶（PEG-DEX和PEI）连接的市售PCU的表面。

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在之前的一项研究中，我们发现AT的共价结合改善了未经处理的PCU的抗血栓特性，而与连接水凝胶[20]的类型无关然而，只有PEG-D游戏辅助自动发卡网EX和PEI与AT [20]联合使用时才有可重复的低血小板粘附的记录因此，我们分析了这些修饰，以验证其在生理条件下的抗血栓功能，如剪切应力。

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根据ISO 10993-4，使用ISO 10993-4模型检测两种表面修饰的血流相容性，以排除表面化学[21]引起的止血激活

二、方法2.1.PCU箔和螺旋PCU移植物的生产芳香族PCU时间flexAR（CF，吸附源生物材料，威尔明顿，MA，美国）按照制造商的说明[1]进行处理箔的加工：将溶解的CF（12 mL）倒入扁平模具（155 mm×25 mm×5 mm）中，并在通风烘箱（诺伊豪森，德国）中干燥（45C，12小时）。

铝箔（厚度，游戏辅助自动发卡网0.5 mm）在一个加热的真空室（粘合剂，塔特林根，德国）中孵育（1.5 mbar，75C，3天）制备圆形（直径6 mm）或矩形样品（12 mm×3.5 mm）螺旋PCU移植物的加工：一个螺旋缠绕的圆形铝制材料（直径，5毫米；长度，600毫米）被安装在一个机器人上（Kuka，奥格斯堡，德国）。

将股票浸入溶解的CF中，机器人在一个气候箱中旋转股票（围绕其螺旋轴和横轴）（定制创建；相对湿度≤30%；28C）浸渍过程重复三次，获得壁厚为0.5 mm在气候室干燥后，将螺旋移植物放入通风的空气箱（45C，12小时），在加热真空室中孵育，浸泡在乙醇（≥99.5%，Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国）（室游戏辅助自动发卡网温，室温；6小时）中，以方便移植物从库存中移除。

2.2.表面改性PEG-DEX-AT修饰：活化的PCU样品在0.1 M碳酸盐缓冲液中孵育，pH缓冲液为0.4/8.6M硫酸钾和1 mg/mL聚乙二醇双胺（聚乙二胺；西格玛-奥尔德里奇）（50C，2h）[22]（PEG）。

用去离子水清洗后，将羧甲基右旋糖酐（DEX）固定在活化的样品表面（PEG-DEX）为了完成固定化，右旋糖酐（Sigma-Aldrich）与溴乙酸[23]反应合成的DEX在EDC/NHS（0.2 M/0.1 M）中孵育20 min。

PEG样品与1 mg/mL活化的右美托咪定在碳酸盐缓冲环境（2 h，RT）（PEG-DEX）中结合在水游戏辅助自动发卡网中冲洗后，PEG-DEX用EDC/NHS（0.1 M/0.1 M）处理，与1 IU/mL人抗凝血酶III（AT；基伯宁P，CLS Behring，马尔堡，德国）在4C孵育过夜。

PEI-AT修饰： pPCU样品与3 mg/mL支链聚乙烯亚胺（PEI，Sigma-Aldirch）（2 h，RT）（PEI）孵育AT在EDC/NHS水溶液（0.2 M/0.1 M）（20 min，RT）中被预激活。

随后，将预激活的AT（1 IU/mL）与PEI样品(19 h，4C）（PEI-AT）孵育所有改性样品均用去离子水洗涤，干燥，并在4℃下保存未处理和修改的PCU样本被数量分配盲法2.3.表面改性材料的弹性和润湿游戏辅助自动发卡网性。

本研究的重点是分析表面修饰的生物学效应因此，只有少数几种方法来描述表面特征：保持弹性（动态力学分析，DMA）和润湿性的检查没有进行傅里叶变换红外（FTIR）和核磁共振（NMR）光谱分析使用DMA分析与温度相关的粘弹性特性，并确定复模量（E0，弹性模量；E00，阻尼值；E00/使用-DMA242C（-杰拉特堡，德国）E00/E0）。

在对样品施加正弦应力（7 N，1 Hz）后，我们在改变温度（100C到100C；加热速率，2 K/min）时，测量了材料中的应变通过这种方法，我们确定了由表面改性引起的矩形箔材料的玻璃化转变温度的变化利用固着液滴的水接触角来评价润湿性。

在样品表面滴入一滴去离子水（游戏辅助自动发卡网2L）我们在精确的10 s后拍摄了液滴，并测量了接触角值[24]每个样品被测量5次，并取平均值2.4.细菌粘附细菌粘附试验：以革兰氏阳性表皮葡萄球菌开始细菌粘附表皮S.是一种常见的人类共生微生物，定植于皮肤和粘膜表面；由于它已经成为一种机会性病原体，它能够定植侵入性医疗设备，导致血流感染[25]。

仅对未经处理的PEG-DEX-AT和PEI-AT样品进行分析将未经处理和改良的PCU盘插入96孔聚丙烯微孔板(Nunc，Thermo Fisher，威豪，美国），培养于细菌悬浮液（100L；12×1051菌落形成单位，CFU mL1），BM培养基（色蛋白酸，10 g/L；酵母提取物，5 g/L；氯化钠游戏辅助自动发卡网，5 g/L；磷酸氢二钾，1 g/L；葡萄糖，1 g/L）（37C，30 min）。

样品在无菌等渗磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在100 rpm的连续振荡下仔细冲洗剩下的溶液用无菌的压缩空气吹走将椎间盘的表面放置在血琼脂平板上（37C，19小时）菌落形成的细菌在琼脂表面产生凹槽，按每个圆盘的表面积计数。

分析了粘附于改良PCU盘中的细菌与未处理的PCU样品的比例细菌增殖试验：未处理和修饰的PCU盘与表皮葡萄球菌孵育8h和120 h，轻轻洗涤，纯甲醇固定，结晶紫（0.2%水溶液；15 min）染色，PBS冲洗。

我们用200L乙醇提取与细菌结合的结晶紫，并在595 nm处测定光密度2.5.血小板粘附性游戏辅助自动发卡网-血液相容性在之前的一项研究中，我们使用静态血小板粘附试验来区分不同表面修饰的血小板粘附，包括所有中间修饰的PCU材料[20]。

简而言之，血浆激活并不能改善血液相容性关键步骤是结合PEG以显著降低血小板粘附随后与DEX和AT的结合没有显示出额外的改善相比之下，PEI单独的结合并不影响血小板的粘附AT的额外偶联诱导了PCU的血栓抵抗的显著增加。

用扫描电镜（SEM）观察PEG-DEX-ATT和PEI-ATT修饰的PCU样品的血小板粘附程度根据机构伦理准则（编号10-101-0159)，从获得书面同意的健康男性志愿者中提取人柠檬酸静脉血富血小板血浆（PRP）的分离，如前面描述的[20]。

对于血小板粘游戏辅助自动发卡网附试验，PRP（50L；5×107个血小板）与PCU样品（37C，5%二氧化碳，30 min）共孵育，用PBS洗涤并按照第2.7节所述进行处理2.6.钱德勒循环实验体外实验采用动态旋转模型（改进的钱德勒环）[26]进行。

这些实验是在图宾根大学医院喉科和心血管外科的实验室中进行的每个螺旋PCU移植物（未治疗和治疗）都填充了12 mL的供者血液这些回路被垂直旋转（37C，90 min）采集血液进行细胞计数和测定补体（SC5b-9）、凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）、多形核（PMN）弹性蛋白酶和-血栓球蛋白（TG）水平。

未接触任何物质的血液作为阴性对照使用市售酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（T游戏辅助自动发卡网G（-TG、诊断、哮喘、法国）；TAT（TAT酶微，施瓦尔巴赫，德国）；PMN-弹性蛋白酶（糖尿病、诊断、基尔，德国）；SC5b-9 (Quidel，圣地亚哥，美国）测定凝血、补体激活和血细胞释放因子的变化。

使用全自动细胞计数器系统（micros 60 ABX血液学，法国蒙彼利埃）在EDTA血液中计数血细胞2.7.扫描电镜（SEM）用扫描电镜验证了改良的螺旋移植物和扁平椎间盘的致血栓性实验结束后，样品用PBS冲洗，用2%戊二醛孵育。

在用PBS广泛冲洗后，然后用40%-100%的乙醇以上升的浓度从移植物中去除剩余的水最后，所有的样品都经过临界点干燥，用金钯溅射，随后用SEM（EVO-LS10，蔡游戏辅助自动发卡网司，奥伯科臣，德国）进行分析2.8.统计量

数据以中位数（IQR，四分位数范围）表示，并在通过弗里德曼检验（Sigma-Stat，SPSS）后，使用威尔克森符号秩检验（Sigma-Stat，SPSS，芝加哥，IL，USA）进行分析≤值为0.05被认为是显著的。

三、结果3.1.机械性能矩形未处理和修正的PCU样品的动态力学弛豫行为如图1所示通过存储模量（E0）的各自下降和棕褐色d和损耗模量（E00）的显著峰值来确定所分析样品的玻璃化转变未处理的PCU样品的玻璃化转变温度高于任何改性的PCU样品（未处理的，24C；PUR-DEX-A，44C；PEI-AT，42C）。

这种玻璃化转变温度的差异归因于改良游戏辅助自动发卡网的PCU样品比未处理的PCU样品具有更大的灵活性不同的表面改性的弹性性能没有差异在37C时，测量值在相同范围内，这表明未处理和修改样品之间的材料性能没有显著差异（E’（Pa）的代表性数据：未处理，9.82；PUR-DEX-A，9.59；PEI-AT，8.77；棕褐色d的数据：未处理，0.094；PUR-DEX-A，0.093；PEI-AT，0.083)。

图1图1：未经处理和改性的聚碳酸酯脲烷（PCU）样品的力学性能未处理和改良PCU样品的(A)弹性模量（E0）和(B)温度d；(C)损失模量曲线（E00）与温度的DMA曲线3.2.润湿性与未处理的PCU样品（78±1.7；p<0.001）相比，在游戏辅助自动发卡网58±2.6)上的水接触角显著降低。

at修饰样品的接触角没有差异（p = 0.081）3.3.改性PCU上的生物膜形成细菌在生物材料表面的粘附和增殖是生物膜形成的必要条件在未经处理的PCU样品中，表皮葡萄球菌的粘附量最高如图2A所示，与未处理的PCU（p≤分别为0.001）相比，PEG-DEX-AT（8% ± 4%）和PEI-AT（23% ± 13%）的cfu显著降低。

此外，在接触所有改良的PCU样品后，细菌增殖均受到抑制只有未经处理的PCU样品在5天后显示生物膜的形成显著增加（p = 0.013；图2B）

图2图2.未处理和改良的PCU样品的细菌粘附和生物膜形成每一种修饰都显著降低了细菌粘附（游戏辅助自动发卡网n = 12）(A)；和生物膜形成（n = 3）(B)；与未处理的PCU相比（，p≤0.05；，p≤0.001）CFU，菌落形成单位。

数据以中位数表示，分别为25/75和5/95百分位（误差条）3.4.静态培养条件下的血液相容性未经处理的PCU样本的表面被纤维蛋白网络和激活的血小板密集覆盖（图3A）活化的血小板显示长假足相比之下，在PEG-DEX-AT和pei-at修饰的表面很少发现血小板沉积（图3B，C）。

可见单个血小板，有少量和短的伪足

图3图3.使用静态血小板粘附试验测定的血小板相容性(A)未经处理的PCU、(B)聚乙二醇双二胺-羧甲基右旋糖酐-抗凝血酶III（PEG-DEX-AT）、和(游戏辅助自动发卡网C)聚乙烯亚胺（PEI）-AT修饰的PCU的代表性样品。

样品与富血小板血浆孵育用扫描电镜（SEM）观察贴壁的血小板插入物的放大倍数更高该试验在5个血小板捐赠者中重复进行（独立实验）3.5.钱德勒循环实验在钱德勒环模型中，90 min再循环后，没有材料显示任何凝块形成的迹象。

扫描电镜显示，未经处理的PCU样本表面有更多的血小板粘附和血细胞粘附（图4）

图4图4：(A)未处理的PCU、(B) PEG-DEX-AT和(C) PEI-AT模型中的肝素化血液再循环后的血小板粘附白色箭头表示扫描电镜（SEM）的代表性图像中粘附的血小板该试验在5名献血者中重复进行（独立实验）。

与对照组血液相比，Ed PCU导游戏辅助自动发卡网致TAT水平显著升高（p≤0.001）未处理的PCU的TAT水平比PEG-DEX-AT（2.1/11.1）高3.4倍（p = 0.012），比PEI-AT（3.2/23.4）高3.7倍（p = 0.002）。

在PEG-DEX-AT的存在下，补体因子SC5b-9的水平显著增加（p≤0.001）（图5B）未处理的PCU和PEI-AT对补体激活无显著影响通过-TG的释放来测量血小板的过度活跃（图5C）未经处理的PCU和PEG-DEX-AT引起了-TG的显著释放（与阴性对照相比，p≤0.001；p≤0.001），但PEI-AT没有诱导血小板活化（p = 0.346）。

PEI-AT的保护作用比未处理的P游戏辅助自动发卡网CU低2.4倍（1.3/6.9）（p≤0.001）这些数据与血小板的数量相关（图5D）血液接触未治疗的PCU和PEG-DEX-AT显著降低了血小板计数（与阴性对照组相比，p=0.007；p=0.003）。

PEI-AT的血小板计数无变化（p = 0.316）两种样品之间没有差异通过释放PMN-弹性蛋白酶来测定粒细胞的活化（图5E）PEG-DEX-AT的炎症反应最高（p≤0.001）未处理的PCU和PEI-AT对白细胞活化无显著影响。

图5图5.使用钱德勒环模型，未经处理和修改的PCU样本对血液反应的影响在90 min (A)凝血酶-抗凝血酶III复合物（TAT）、(B) SC5b-9、(C)-血栓游戏辅助自动发卡网球蛋白（-TG）、(D)血小板计数和(E)PMN-弹性蛋白酶（PMN，多形核）后检测特异性参数。

来自5次独立运行的数据以中位数表示，分别为25/75和5/95的百分位数（误差条）统计数据：*，与对照组相比变化显著（*，p≤0.05；**，p≤0.05；***，p≤0.001)；$，与未处理的PCU样本相比差异显著（$，p≤0.05；$$，p≤0.05；$$$，p≤0.001)。

四、论述化学修饰已被用于改善血液相容性，作为植入VAD系统[20]泵室的血液相容性在本研究中使用的改良PCU样品中，PEI-AT修饰对力学性能影响较小，润湿力增强，细菌细胞结合减少，血小板粘附和活化抑制，剪应力下补体和凝游戏辅助自动发卡网血激活。

等离子体处理和化学修饰改变了慢性氧化AR的物理和热性能我们研究中采用的每一种改性都降低了PCU的玻璃化转变温度，这是由于改性的PCU盘[27,28]具有更大的灵活性这两种修改在弹性性能上没有区别每一种表面修饰都显著降低了表皮葡萄球菌对未处理的PCU样品的粘附和增殖。

PEG或pei基水凝胶的引入可能负责防止细菌粘附[29,30]Park等[29]在聚氨酯表面使用了不同的聚乙二醇修饰，显示表皮葡萄球菌在磺化聚乙二醇、长链聚乙二醇和肝素化聚乙二醇表面的粘附显著降低由于聚乙二醇对水[31]的高熵和强亲和力，具有防污性能，显著降低了蛋白质的吸附和细菌的粘附性。

此外，用疏水n-烷基-pei聚阳离子游戏辅助自动发卡网涂覆玻璃或聚乙烯载玻片可以杀死革兰氏阳性的人类病原体金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌[32]这些表面修饰可能有助于减少细菌在医疗设备上的定植临床数据反映了这种抗菌表面涂层的必要性。

罗森feldt等人[33]在一项单中心研究中显示，45%的VAD患者出现VAD相关菌血症，发生率为每1000个支持天5.6次本研究中at修饰的样品抵抗血小板粘附和活化，扫描电镜显示令人印象深刻在静态条件下，活化的血小板聚集在未经处理的PCU表面，并产生广泛的纤维网络。

其他研究[2,14,34]批准了未经处理的聚氨酯的血液相容性不足，限制了其在血液接触应用中的应用我们认为未处理的PCU的疏水性导致了血小板更高的粘附游戏辅助自动发卡网PEG-DEX-AT和PEI-AT修饰的固定降低了表面的疏水性，阻止了血小板粘附，抑制了粘附血小板的扩散和伪足变形，这表明改善了血液相容性。

在之前的一项研究中，我们的小组证明，在静态[20]条件下，PEG-DEX和PEI水凝胶与血浆激活的PCU的结合显著降低了血小板粘附Coll Ferrer等人的[35]证实了这一点额外的AT固定并没有改善材料[20]的血栓抗性。

但不能排除固定化AT具有其生理功能Ito等人的[36]也得到了类似的结果，他合成了一种凝血酶抑制剂的丙烯酰胺衍生物，并将其聚合到聚合物膜的表面这种结构使凝血酶失活并抑制血小板的粘附此外，表面涂覆直接凝血酶抑制剂阿加曲班，可减少体外循环游戏辅助自动发卡网电路[15]中的血栓形成。

最后，考虑到钱德勒-环模型，血液接触装置不仅与血液直接接近，而且与血液交互，而且与整个循环血容量[37,38]钱德勒-环模型模拟了动脉血流条件[39,40]，并能够根据ISO 10993-4标准测试[41]进行人工材料的血液相容性测试。

聚氨酯有限的血流相容性表现为凝血级联反应的激活，例如TAT和-TG水平的增加和血小板计数的减少，而补体和炎症系统仅受到轻微的影响当PCU与固定化AT接触时，止血反应的改变被抑制然而，只有PEI-AT修饰显著降低了凝血（TAT）和血小板活化（-TG），而没有改变补体和粒细胞反应。

PEG-DEX-AT修饰仅降低了TAT水平；血小板活化保持较游戏辅助自动发卡网高，补体和炎症系统受到刺激，血小板粘附在改良的管状移植物的内表面使用钱德勒-环模型，我们能够在一个实验设置中比较两种以上不同的PCU表面修饰，这是其他体外和体内模型的一个主要局限性。

然而，我们研究的一个局限性是改良的PCU盘（FTIR，NMR）的表面表征有限，以及中间修饰的PCU样品的数据缺失更多的细节已经发布了[20]此外，对AT功能的机制研究也失败了然而，本研究的重点是剪应力下不同表面修饰对人血细胞的生物学响应。

进一步的研究将需要进一步的表征，特别是表面性质五、结论虽然PEG-DEX-AT和PEI-AT都显著降低了凝血活化，但只有PEI-AT能产生抗菌和抗血栓形成的功能未来的研究将显示这种游戏辅助自动发卡网修饰是否适合于心血管组织工程。

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